A fehérje minden élőlény lényeges alkotóeleme. Mindegyik molekulája egy vagy több aminosavakból álló polipeptidláncból áll. Bár az élethez szükséges információkat a DNS vagy az RNS kódolja, a rekombináns fehérjék számos biológiai funkciót látnak el az organizmusokban, beleértve az enzimatikus katalízist, védelmet, támogatást, mozgást és szabályozást. A szervezetben betöltött funkcióik szerint ezek az anyagok különböző kategóriákba sorolhatók, például antitestek, enzimek, szerkezeti komponensek. Tekintettel fontos funkciójukra, az ilyen vegyületeket intenzíven tanulmányozták és széles körben használják.
Régebben a rekombináns fehérje előállításának fő módja az volt, hogy azt természetes forrásból izolálták, ami általában nem hatékony és időigényes. A biológiai molekuláris technológia közelmúltbeli fejlődése lehetővé tette, hogy egy meghatározott anyagokat kódoló DNS-t klónozzanak egy expressziós vektorba olyan anyagok számára, mint a baktériumok, élesztőgombák, rovarsejtek és emlőssejtek.
Egyszerűen fogalmazva, a rekombináns fehérjéket exogén DNS-termékek fordítják leélő sejtek. Megszerzésük általában két fő lépésből áll:
- Molekula klónozása.
- Fehérje kifejezés.
Jelenleg egy ilyen szerkezet előállítása az egyik leghatékonyabb módszer az orvostudományban és a biológiában. A kompozíció széles körben alkalmazható a kutatásban és a biotechnológiában.
Orvosi irányítás
A rekombináns fehérjék fontos kezelést biztosítanak különféle betegségek, például cukorbetegség, rák, fertőző betegségek, hemofília és vérszegénység kezelésére. Az ilyen anyagok tipikus formulái közé tartoznak az antitestek, hormonok, interleukinek, enzimek és antikoagulánsok. Egyre nagyobb az igény a terápiás felhasználású rekombináns készítményekre. Lehetővé teszik a kezelési módszerek kiterjesztését.
a genetikailag módosított rekombináns fehérjék kulcsszerepet játszanak a terápiás gyógyszerpiacon. Jelenleg az emlőssejtek termelik a legtöbb terápiás szert, mert készítményeik kiváló minőségű, természetes jellegű anyagok előállítására képesek. Ezenkívül számos jóváhagyott rekombináns terápiás fehérje termelődik E. coli-ban a jó genetika, a gyors növekedés és a magas termelékenység miatt. Pozitív hatással van az ezen az anyagon alapuló gyógyszerek kifejlesztésére is.
Kutatás
A rekombináns fehérjék beszerzése különböző módszereken alapul. Az anyagok segítenek megismerni a szervezet alap- és alapelveit. Ezek a molekulák azonosításra és meghatározására használhatókegy adott gén által kódolt anyag helyének meghatározása, és más gének funkciójának feltárása a különböző sejttevékenységekben, mint például a sejtjelátvitel, az anyagcsere, a növekedés, a replikáció és a pusztulás, a transzkripció, a transzláció és a cikkben tárgy alt vegyületek módosítása.
Így a megfigyelt összetételt gyakran használják a molekuláris biológiában, sejtbiológiában, biokémiában, szerkezeti és biofizikai vizsgálatokban és sok más tudományterületen. Ugyanakkor a rekombináns fehérjék előállítása nemzetközi gyakorlat.
Az ilyen vegyületek hasznos eszközök az intercelluláris kölcsönhatások megértésében. Hatékonynak bizonyultak számos laboratóriumi módszerben, mint például az ELISA és az immunhisztokémia (IHC). A rekombináns fehérjék felhasználhatók enzimvizsgálatok kifejlesztésére. Egy pár megfelelő antitesttel kombinálva a sejtek szabványként használhatók az új technológiákhoz.
Biotechnológia
Az aminosav-szekvenciát tartalmazó rekombináns fehérjéket az iparban, az élelmiszergyártásban, a mezőgazdaságban és a biomérnöki iparban is használják. Például az állattenyésztésben enzimeket lehet hozzáadni az élelmiszerekhez, hogy növeljék a takarmány-összetevők tápértékét, csökkentsék a költségeket és a hulladékot, támogassák az állatok bélrendszerének egészségét, javítsák a termelékenységet és javítsák a környezetet.
Ezenkívül a tejsavbaktériumok (LAB) hosszú ideigfermentált élelmiszerek előállítására használták, és a közelmúltban a LAB-ot olyan aminosavszekvenciát tartalmazó rekombináns fehérjék expressziójára fejlesztették ki, amelyek széles körben alkalmazhatók például az emberi, állati és táplálkozási emésztés javítására.
Azonban ezeknek az anyagoknak is vannak korlátai:
- Bizonyos esetekben a rekombináns fehérjék előállítása bonyolult, költséges és időigényes.
- Előfordulhat, hogy a sejtekben termelődő anyagok nem egyeznek a természetes formákkal. Ez a különbség csökkentheti a terápiás rekombináns fehérjék hatékonyságát, sőt mellékhatásokat is okozhat. Ezenkívül ez a különbség befolyásolhatja a kísérletek eredményeit.
- A fő probléma az összes rekombináns gyógyszerrel az immunogenitás. Minden biotechnológiai termék mutathat valamilyen immunogenitást. Nehéz megjósolni az új terápiás fehérjék biztonságosságát.
Általában a biotechnológia fejlődése növelte és megkönnyítette a rekombináns fehérjék előállítását különféle alkalmazásokhoz. Bár még mindig vannak hátrányai, ezek az anyagok fontosak az orvostudományban, a kutatásban és a biotechnológiában.
Betegség link
rekombináns fehérje nem káros az emberre. Egy adott gyógyszer vagy táplálkozási elem kifejlesztésében csak a teljes molekula szerves része. Számos orvosi tanulmány kimutatta, hogy az FGFBP3 fehérje (rövidítve BP3) erőszakos expressziója elhízott egerek laboratóriumi törzsében a testzsír jelentős csökkenését mutatta.tömeg, a genetikai hajlam ellenére.
E vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy az FGFBP3 fehérje új terápiát kínálhat a metabolikus szindrómával összefüggő rendellenességek, például a 2-es típusú cukorbetegség és a zsírmájbetegség kezelésére. De mivel a BP3 természetes fehérje, és nem mesterséges gyógyszer, a rekombináns humán BP3 klinikai vizsgálatai a preklinikai vizsgálatok utolsó fordulója után kezdődhetnek. Be, vagyis vannak okok az ilyen vizsgálatok elvégzésének biztonságosságához. A rekombináns fehérje lépcsőzetes feldolgozása és tisztítása miatt nem káros az emberre. Változások zajlanak molekuláris szinten is.
A PD-L2, az immunterápia egyik kulcsszereplője, 2018-ban fiziológiai és orvosi Nobel-díjra jelölték. Ez a munka, amelyet Prof. James P. Allison az Egyesült Államokból és Prof. Tasuku Honjo Japánból indított el, olyan rákos megbetegedések kezeléséhez vezetett, mint a melanoma, tüdőrák és mások, ellenőrzőpontos immunterápia alapján. A közelmúltban az AMSBIO egy jelentős új termékkel egészítette ki immunterápiás termékcsaládját, a PD-L2/TCR aktivátort, a CHO rekombináns sejtvonalat.
A koncepcionális kísérletekben a birminghami Alabama Egyetem kutatói H. Long Zheng, MD, Robert B. Adams professzor és az UAB School of Patológiai Tanszékének laboratóriumi orvostudományi igazgatója vezetésével. Az orvostudomány egy lehetséges terápiát emelt ki egy ritka, de végzetes vérzési rendellenesség, a TTP.
Ennek eredményeitanulmányok először mutatják be, hogy az rADAMTS13-mal feltöltött vérlemezkék transzfúziója új és potenciálisan hatékony terápiás megközelítés lehet a veleszületett és immunmediált TTP-vel összefüggő artériás trombózis kezelésére.
A rekombináns fehérje nem csak tápanyag, hanem gyógyszer is a fejlesztés alatt álló gyógyszer összetételében. Ez csak néhány olyan terület, amely ma már az orvostudományban érintett, és minden szerkezeti elemének vizsgálatához kapcsolódik. Amint azt a nemzetközi gyakorlat mutatja, egy anyag szerkezete lehetővé teszi molekuláris szinten az emberi szervezet számos súlyos problémájának kezelését.
Vakcinafejlesztés
A rekombináns fehérje molekulák egy specifikus halmaza, amely modellezhető. Hasonló tulajdonságot alkalmaznak a vakcinák fejlesztése során is. Az Edinburghi Egyetem és a Pirbright Intézet kutatói szerint egy új vakcinázási stratégia, amelyet egy speciális rekombináns vírusinjekciónak is neveznek, több millió csirkét védhet meg egy súlyos légúti betegségtől. Ezek a vakcinák a vírusok vagy baktériumok ártalmatlan vagy gyenge változatait használják fel a baktériumok bejuttatására a szervezet sejtjeibe. Ebben az esetben a szakértők különböző tüskefehérjéket tartalmazó rekombináns vírusokat használtak vakcinaként egy ártalmatlan vírus két változatának létrehozására. Sok különböző gyógyszer épül erre a kapcsolatra.
A rekombináns fehérje kereskedelmi nevei és analógjai a következők:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Ezek főleg rákellenes szerek, de más kezelési területek is kapcsolódnak ehhez a hatóanyaghoz.
A Nature Communications tudományos folyóiratban megjelent új tanulmány szerint egy új vakcina, más néven LASSARAB, amelyet arra terveztek, hogy megvédje az embereket a Lassa-láz és a veszettség ellen, ígéretes eredményeket mutatott a preklinikai vizsgálatok során. Az inaktivált rekombináns vakcina legyengített veszettségvírust használ.
A kutatócsoport a Lassa vírus genetikai anyagát építette be egy veszettség vírus vektorba, hogy a vakcina felszíni fehérjéket expresszáljon mind Lassa, mind veszettség sejtekben. Ezek a felületi vegyületek immunválaszt váltanak ki a fertőző ágensek ellen. Ezt a vakcinát azután inaktiválták, hogy „elpusztítsák” a hordozó előállításához használt élő veszettségvírust.
Módszerek beszerzése
Több rendszer létezik egy anyag előállítására. A rekombináns fehérje előállításának általános módszere a szintézisből származó biológiai anyag kinyerésén alapul. De vannak más módok is.
Jelenleg öt fő kifejezési rendszer létezik:
- E. coli expressziós rendszer.
- Élesztő expressziós rendszer.
- Rovarsejt expressziós rendszer.
- Emlőssejtek expressziós rendszere.
- Sejtmentes fehérje expressziós rendszer.
Ez utóbbi lehetőség különösen alkalmas transzmembrán fehérjék expressziójáraés mérgező vegyületek. Az elmúlt években a hagyományos intracelluláris módszerekkel nehezen expresszálható anyagokat sikeresen integrálták a sejtekbe in vitro. Fehéroroszországban széles körben alkalmazzák a rekombináns fehérjék előállítását. Számos állami tulajdonú vállalat foglalkozik ezzel a kérdéssel.
Sejtmentes fehérjeszintézis rendszer egy gyors és hatékony módszer a célanyagok szintetizálására a sejtkivonatok enzimrendszerében a transzkripcióhoz és transzlációhoz szükséges különféle szubsztrátok és energiavegyületek hozzáadásával. Az elmúlt években fokozatosan megjelentek a sejtmentes módszerek előnyei olyan anyagok esetében, mint például a komplex, toxikus membránok, ami bemutatja lehetséges alkalmazásukat a biofarmakon.
A sejtmentes technológia számos, természetben nem előforduló aminosavat tud egyszerűen és ellenőrzött módon hozzáadni, hogy olyan összetett módosítási folyamatokat érjen el, amelyeket a hagyományos rekombináns expressziót követően nehéz feloldani. Az ilyen módszerek nagy alkalmazási értékkel és vírusszerű részecskéket használó gyógyszerbejuttatási és vakcinafejlesztési potenciállal rendelkeznek. Számos membránfehérje expresszálódott sikeresen szabad sejtekben.
Kompozíciók kifejezése
A CFP10-ESAT 6 rekombináns fehérjét állítják elő és használják fel vakcinák létrehozására. Az ilyen tuberkulózis allergén lehetővé teszi az immunrendszer erősítését és antitestek kifejlesztését. Általánosságban elmondható, hogy a molekuláris vizsgálatok egy fehérje bármely aspektusának vizsgálatát foglalják magukban, például szerkezetet, funkciót, módosításokat, lokalizációt vagy kölcsönhatásokat. Felfedeznihogy bizonyos anyagok hogyan szabályozzák a belső folyamatokat, a kutatóknak általában olyan eszközökre van szükségük, amelyek érdekes és előnyös funkcionális vegyületeket állíthatnak elő.
A fehérjék méretére és összetettségére tekintettel a kémiai szintézis nem járható út ehhez a törekvéshez. Ehelyett az élő sejteket és azok sejtrendszerét általában gyárként használják anyagok létrehozására és megalkotására a biztosított genetikai sablonok alapján. A rekombináns fehérje expressziós rendszer ezután létrehozza a szükséges szerkezetet a gyógyszer létrehozásához. Ezután következik a különböző kategóriájú gyógyszerekhez szükséges anyagok kiválasztása.
A fehérjékkel ellentétben a DNS könnyen előállítható szintetikusan vagy in vitro jól bevált rekombináns technikákkal. Ezért specifikus gének DNS-templátai, hozzáadott riporterszekvenciákkal vagy affinitástoldalék-szekvenciákkal vagy anélkül, megtervezhetők templátként a megfigyelt anyag expressziójához. Az ilyen DNS-templátokból származó ilyen vegyületeket rekombináns fehérjéknek nevezzük.
Egy anyag kifejeződésének hagyományos stratégiái a sejtek transzfektálását tartalmazzák egy DNS-vektorral, amely egy templátot tartalmaz, majd a sejteket tenyésztik a kívánt fehérje átírása és lefordítása érdekében. Jellemzően a sejteket azután lizálják, hogy extrahálják az expresszált vegyületet a későbbi tisztításhoz. A CFP10-ESAT6 rekombináns fehérjét ily módon dolgozzák fel, és egy tisztító rendszeren megy keresztül a lehetségestoxinok képződése. Csak ezután szintetizálódik vakcinává.
Mind a prokarióta, mind az eukarióta in vivo expressziós rendszert széles körben használják molekuláris anyagokhoz. A rendszer kiválasztása a fehérje típusától, a funkcionális aktivitás követelményétől és a kívánt hozamtól függ. Ezek az expressziós rendszerek magukban foglalják az emlősöket, rovarokat, élesztőket, baktériumokat, algákat és sejteket. Minden rendszernek megvannak a maga előnyei és kihívásai, és az adott alkalmazáshoz megfelelő rendszer kiválasztása fontos a vizsgált anyag sikeres kifejezéséhez.
Elősök kifejezése
A rekombináns fehérjék használata lehetővé teszi különböző szintű vakcinák és gyógyszerek kifejlesztését. Ehhez az anyag beszerzésének ez a módszere használható. Az emlős expressziós rendszerekkel olyan fehérjéket lehet előállítani az állatvilágból, amelyek fiziológiailag releváns környezetüknek köszönhetően a legnatívabb szerkezettel és aktivitással rendelkeznek. Ez magas szintű poszttranszlációs feldolgozást és funkcionális aktivitást eredményez. Az emlős expressziós rendszerek felhasználhatók antitestek, komplex fehérjék és sejtalapú funkcionális vizsgálatokhoz használható vegyületek előállítására. Ezek az előnyök azonban szigorúbb tenyésztési feltételekkel párosulnak.
Emlős expressziós rendszerek felhasználhatók fehérjék átmeneti vagy stabil sejtvonalakon keresztül történő előállítására, ahol az expressziós konstrukció integrálódik a gazda genomjába. Míg az ilyen rendszerek több kísérletben is használhatók, az időa termelés nagy mennyiségű anyagot képes előállítani egy-két hét alatt. Az ilyen típusú rekombináns fehérje biotechnológia iránt nagy a kereslet.
Ezek az átmeneti, nagy hozamú emlős expressziós rendszerek szuszpenziós tenyészeteket használnak, és gramm/liter hozamot tudnak adni. Ezen túlmenően ezek a fehérjék több natív hajtogatási és poszttranszlációs módosulással rendelkeznek, mint például glikoziláció, mint más expressziós rendszerek.
Rovarkifejezés
A rekombináns fehérje előállítására szolgáló módszerek nem korlátozódnak emlősökre. Vannak termelékenyebb módszerek is az előállítási költségek tekintetében, bár az anyag hozama 1 liter kezelt folyadékra vonatkoztatva sokkal alacsonyabb.
A rovarsejtek felhasználhatók magas szintű fehérje expresszálására, az emlősrendszerekhez hasonló módosításokkal. Számos rendszer használható rekombináns bakulovírus előállítására, amely aztán felhasználható a számunkra érdekes anyag rovarsejtekből való kivonására.
A rekombináns fehérjék expressziói könnyen méretezhetők és adaptálhatók nagy sűrűségű szuszpenziós tenyészetekhez a molekulák nagy léptékű összekeverésére. Funkcionálisan jobban hasonlítanak az emlősök natív összetételére. Bár a hozam akár 500 mg/l is lehet, a rekombináns bakulovírus előállítása időigényes lehet, és a tenyésztési körülmények nehezebbek, mint a prokarióta rendszerek. A délibb és melegebb országokban azonban hasonlómódszert hatékonyabbnak tartják.
Baktériumkifejezés
A rekombináns fehérjék termelése baktériumok segítségével megalapozható. Ez a technológia nagyban különbözik a fent leírtaktól. A bakteriális fehérje expressziós rendszerek népszerűek, mivel a baktériumok könnyen tenyészthetők, gyorsan szaporodnak, és magas hozamot adnak a rekombináns készítményből. A baktériumokban expresszált többdoménes eukarióta anyagok azonban gyakran nem működőképesek, mivel a sejtek nincsenek felszerelve a szükséges poszttranszlációs módosítások vagy molekuláris hajtogatások elvégzésére.
Ezen túlmenően sok fehérje zárványmolekulaként oldhatatlanná válik, amelyeket nagyon nehéz visszanyerni kemény denaturátorok és az ezt követő nehézkes molekuláris újrahajtogatási eljárások nélkül. Ez a módszer többnyire még nagyrészt kísérleti jellegű.
Cell szabad kifejezés
A sztafilokináz aminosav-szekvenciáját tartalmazó rekombináns fehérjét némileg eltérő módon állítják elő. Sokféle injekcióban megtalálható, használat előtt több rendszer szükséges.
Sejtmentes fehérjeexpresszió egy anyag in vitro szintézise, transzlációsan kompatibilis teljes sejtkivonatok felhasználásával. Elvileg a teljes sejtkivonatok tartalmazzák a transzkripcióhoz, transzlációhoz és még a transzláció utáni módosításhoz szükséges összes makromolekulát és komponenst.
Ezek a komponensek közé tartozik az RNS-polimeráz, a szabályozó fehérjefaktorok, a transzkripciós formák, a riboszómák és a tRNS. Hozzáadáskorkofaktorok, nukleotidok és egy specifikus génsablon, ezek a kivonatok néhány óra alatt képesek szintetizálni a számunkra érdekes fehérjéket.
Bár nagyüzemi termelésre nem fenntartható, a sejtmentes vagy in vitro fehérje expressziós (IVT) rendszerek számos előnnyel rendelkeznek a hagyományos in vivo rendszerekkel szemben.
A sejtmentes expresszió lehetővé teszi a rekombináns készítmények gyors szintézisét sejttenyésztés nélkül. A sejtmentes rendszerek lehetővé teszik a fehérjék módosított aminosavakkal történő jelölését, valamint olyan vegyületek expresszálását, amelyek az intracelluláris proteázok által gyors proteolitikus lebontáson mennek keresztül. Ezen túlmenően, sejtmentes módszerrel (például fehérjemutációk tesztelésével sok különböző rekombináns DNS-templátból származó kis léptékű expresszióval) könnyebb egyidejűleg sok különböző fehérjét expresszálni. Ebben a reprezentatív kísérletben az IVT rendszert használták a humán kaszpáz-3 fehérje expresszálására.
Következtetések és jövőbeli kilátások
A rekombináns fehérjetermelés mára már érett tudományágnak tekinthető. Ez a tisztítás és elemzés számos fokozatos fejlesztésének eredménye. Jelenleg a gyógyszerkutatási programokat ritkán állítják le a célfehérje termelésének képtelensége miatt. Számos rekombináns anyag kifejezésére, tisztítására és elemzésére szolgáló párhuzamos eljárások ma már jól ismertek a világ számos laboratóriumában.
Fehérjekomplexek és egyre növekvő siker az előállításbanA szolubilizált membránszerkezetek további változtatásokat igényelnek, hogy lépést tudjanak tartani az igényekkel. A rendszeresebb fehérjeellátás érdekében hatékony szerződéses kutatószervezetek megjelenése lehetővé teszi a tudományos erőforrások átcsoportosítását, hogy megfeleljenek ezeknek az új kihívásoknak.
Ezenkívül a párhuzamos munkafolyamatoknak lehetővé kell tenniük a megfigyelt anyag teljes könyvtárainak létrehozását, amelyek lehetővé teszik az új célpont azonosítását és a fejlett szűrést, valamint a hagyományos kis molekulájú gyógyszerkutatási projekteket.
