A körülöttünk lévő természetben élő mikroorganizmusok mindenhol megtalálhatók: talajokban, víztestekben, különféle tárgyak felszínén emberek és állatok élnek velük. Mindez élelmiszerek, gyógyszerek és gyártósorok mikrobiális szennyeződésének forrásaként szolgálhat. A baktériumok tenyésztése szükséges tulajdonságaik, szükségleteik és jellemzőik tanulmányozásához. Ez viszont fontos lépés a különféle gyógyszerek fejlesztésében, a betegségek laboratóriumi diagnosztikájában, a termelőreaktorok számításában és még sok másban.
Általános fogalmak
A baktériumok tenyésztése a mikrobiológiában a mikroorganizmusok laboratóriumban végzett tenyésztését jelenti. Azokat a mikrobákat viszont, amelyek egy kiválasztott táptalajon nőttek fel, kultúrának nevezik. A kultúrák keverhetők, ha különböző típusú mikroorganizmusok alkotják őket, és tisztaak, ha csak egyfajta baktérium képviseli őket.
Ha táplálkozásiCsak egy sejt kerül a táptalajba, és ennek szaporodása eredményeként egy egyedcsoport keletkezik, majd ezt a mikroorganizmus-készletet klónnak nevezzük. Amikor egy klón annyira fejlődik, hogy szabad szemmel is láthatóvá válik, ezt a baktériumgyűjteményt kolóniának nevezik.
A különböző forrásokból izolált baktériumok tenyésztését általában egymástól elkülönítve végzik. Minden ilyen külön-külön termesztett mikrobacsoportot törzsnek nevezünk. Tehát, ha egy staphylococcus-típust három forrásból (vagy ugyanannak a terméknek különböző részeiből, különböző emberekből) izolálnak, akkor az ilyen típusú staphylococcusok három törzséről beszélnek.
Baktériumnövekedési tényezők
Ezek közé tartoznak a különböző aminosavak, lipidek, purinbázisok és más, a mikroorganizmusok fejlődéséhez szükséges vegyületek. Egyes mikrobák önállóan képesek előállítani a számukra szükséges anyagokat, míg másoknak kész formában kell megkapniuk azokat. Az egyes növekedési faktorokban lévő mikroorganizmusok igényei szerint a baktériumok azonosítását és differenciálását végzik el. Ezenkívül ez a paraméter fontos a táptalaj megfelelő előkészítéséhez laboratóriumi és biotechnológiai munkákhoz:
- Aminósavak. A baktériumoknak egy adott aminosavra vagy savak csoportjára lehet szükségük. Tehát a klostrídiumoknak leucinra és tirozinra, a streptococcusoknak leucinra és argininre van szükségük. Azokat a mikroorganizmusokat, amelyek növekedéséhez kívülről származó aminosavakat igényelnek, auxotrófoknak nevezzük.
- Purin- és pirimidinbázisok, valamint származékaik (adenin, guanin és mások). Sokak növekedésének fontos tényezőiStreptococcus fajok.
- Vitaminok. A baktériumok által igényelt koenzimek részét képezik. Tehát a nikotinsavra, valamint amidjára, amelyek a NAD és NADP részét képezik, szükségük van a diftéria és a shigella corynebacteria számára. A tiamint, mint a pirofoszfát szerves részét, a Staphylococcus aureus, a pneumococcus, a brucella igényli. A pantoténsavat, amely a CoA koenzim része, a tetanuszbacillusok és bizonyos típusú streptococcusok igényelnek. A citokrómok, és így az ezeket alkotó folsav, hemek és biotin szükségesek a Mycobacterium tuberculosis és a Haemophilus influenzae számára.
Környezeti követelmények
A baktériumtenyésztéshez használt táptalaj feltételei:
- Táplálkozás. Tartalmazniuk kell olyan anyagokat, továbbá könnyen emészthető formában, amelyek szükségesek a mikroorganizmusok táplálásához és energiapótlásához. Ide tartoznak az organogének és ásványi anyagok. Egyes mikroorganizmusok emellett vitaminokat és aminosavakat igényelnek, amelyeket nem tudnak szintetizálni.
- Optimális pH-szint. Befolyásolja a sejtmembrán permeabilitását és ennek megfelelően a baktérium tápanyagfelvételi képességét. A pH érték leggyakrabban 7, 2-7, 4 között legyen. Sok mikroorganizmus élete során savas vagy lúgos reakciókkal hoz létre termékeket, és annak érdekében, hogy a tápközeg pH-ja ne változzon, pufferelni kell.
- Izotóniás. A baktériumok tenyésztéséhez szükséges tápközeg ozmotikus nyomásának azonos értékekkel kell rendelkezniea mikrobiális sejtek belsejében. Általában 0,5%-os NaCl-oldatnak felel meg.
- Sterilitás. Ez annak a ténynek köszönhető, hogy az idegen baktériumok megjelenése torzítja az elemzett törzs vizsgálatának eredményeit.
- Páratartalom. Ennek a mutatónak a táptalaj konzisztenciájával együtt optimális jellemzőkkel kell rendelkeznie egy adott típusú baktérium számára.
- Redox potenciál (RH2). Megmutatja az elektronokat adományozó és befogadó anyagok arányát, valamint a tápközeg oxigéntelítettségi szintjét. Az aerobok és anaerobok esetében a baktériumok tenyésztésének feltételei némileg eltérnek ebben a mutatóban. Az anaerob mikroorganizmusok 5 alatti RH2 értéknél szaporodnak a legjobban, az aerob mikroorganizmusok pedig legalább 10.
- Egységesség. Fontos, hogy a táptalaj állandó mennyiségben tartalmazza az egyes összetevőket. Ezenkívül előnyben részesítik az átlátszó megoldásokat, amelyek megkönnyítik a termésnövekedés nyomon követését vagy a szennyeződés észlelését.
A táptalaj típusai
A mikroorganizmusok szaporodására szolgáló adott táptalaj kiválasztását számos tényező befolyásolja, többek között táplálkozásuk jellemzői és a vizsgálat célja. A tápközegek osztályozásának alapját képező főbb jellemzők a következők:
1. Alkatrészek. Az aljzat létrehozásához használt kezdeti anyagok szerint megkülönböztetik:
- természetes, melyek állati vagy növényi eredetű termékekből (pl. hús, tej, gyümölcs) készülnek és vegyes termesztésre alkalmasaknövények;
- félszintetikus, amelyben a drága természetes élelmiszereket nem élelmiszer termékekkel helyettesítik (például csontliszt, vérrögök), és amelyek optimálisak bizonyos típusú baktériumok tenyésztésére vagy anyagcseretermékeik izolálására a környezet;
- szintetikus anyagok, amelyeket precíz mennyiségű kémiai vegyületből állítanak elő, ismert állandó összetételűek és könnyen reprodukálhatók.
2. Konzisztencia (sűrűség). Környezetek megkülönböztetése:
- folyékony;
- sűrű;
- félig folyékony.
Az utolsó kettő speciális oldatokból vagy folyékony anyagokból készül, agar-agar vagy zselatin hozzáadásával a kívánt sűrűség létrehozása érdekében. Ezenkívül a baktériumok szaporodásának sűrű környezete az alvadt vérszérum, a burgonya, a szilikagél táptalaj, a karragenán.
3. Összetett. Ezen az alapon a környezetek a következők:
- egyszerű, amelyek listája rövid: húspeptonleves (MBB), Hottinger húsleves és agar, húspepton-agar (MPA), tápanyag zselatin és peptonvíz.
- komplex, egyszerűekből vér, savó, szénhidrát és egyéb anyagok hozzáadásával készítve.
4. Időpont egyeztetés. A következő tápközegeket különböztetjük meg:
- főként számos patogén mikroba szaporodására használják (általában egyszerű összetételű);
- különlegeseket használnak olyan baktériumok izolálására és tenyésztésére, amelyek nem szaporodnak egyszerű szubsztrátumokon;
- szelektívek (szelektívek is) alkalmasak egy adott típusú baktérium izolálására és gátolják a kapcsolódó mikrobák növekedését (szelektivitás)bizonyos anyagok, például antibiotikumok vagy sók közeghez való hozzáadásával vagy a pH beállításával jön létre);
- a differenciáldiagnosztika lehetővé teszi a baktériumok egyik típusának megkülönböztetését a másiktól azáltal, hogy értékeli például a táptalaj enzimaktivitását;
- tartósítószerek szükségesek a kezdeti beoltáshoz és a későbbi mintaszállításhoz, mivel megakadályozzák a mikroorganizmusok elpusztulását, valamint gátolják más baktériumok növekedését.
Média-előkészítés
Az anaerob baktériumok tenyésztésének legfontosabb lépése a megfelelő táptalaj elkészítése. Az optimális paraméterek kiválasztása után folytassa a következő lépésekkel:
- mérleg, az összetevők mintájának kiválasztásával egy analitikai mérlegen;
- az oldást 70 °C-ra melegített desztillált vízben végezzük, és a foszfátokat, mikro- és makrosókat külön-külön oldjuk fel;
- vízfürdőben forraljuk két percig;
- pH meghatározása indikátorpapírral vagy potenciométerrel;
- nedves ruhán vagy papírszűrőn keresztül történő szűrés folyékony és olvadt, sűrű tápközeg esetén, és pamut-gézszűrőn keresztül agar tápközeg esetén;
- palackozás 3/4 kapacitással;
- közepes függő sterilizálás;
- a sterilitás ellenőrzése két napig termosztátban való ülepítéssel, majd megtekintéssel történik;
- kémiai ellenőrzés a pH és a szükséges tartalom megállapításáratételek;
- biológiai kontroll próbaoltással.
Üvegáruk és hordozók sterilizálása
A baktériumtenyésztés egyik alapelve a sterilitás. Az idegen mikroorganizmusok növekedése és fejlődése befolyásolhatja a tápközeg jellemzőit a kémiai összetételének és pH-jának megváltoztatásával. A tiszta kultúrák termesztésének fő feltétele a sterilizálás. A gyakorlatban ez a kifejezés abszolút minden életforma megsemmisítésének módszereit jelenti a sterilizált tárgyak felszínén és térfogatában. A vizsgálat során használt edényeket, eszközöket, médiát és egyéb tárgyakat sterilizálják.
Egyes sterilizálási típusok:
- Gyújtás. A hurkok és tűk sterilizálása vetéshez, üveglemezek, egyes műszerek égővel vagy szellemlámpával is elvégezhetők.
- Forrás. Alkalmas fecskendők, tűk, élelmiszerek kezelésére, de nem pusztítja el a baktériumspórákat.
- Száraz hősterilizálás. Speciális szárítószekrényben végzik, és alkalmas lombikok, kémcsövek és egyéb laboratóriumi üvegedények feldolgozására.
- Gőzsterilizálás. Az autoklávban végrehajtott módszer rendkívül hatékony. De nem alkalmas fehérjéket vagy más, magas hőmérsékleten lebomló vegyületet tartalmazó táptalajokhoz. A kíméletesebbet nevezhetjük tyndalizálásnak. A Koch Boilerben hajtják végre, és egyesíti a spórák csírázását azok elpusztításával.
- Pasztőrözés. Olyan közegekhez használják, amelyek forralva megváltoztatják tulajdonságaikat (például tej, bor, sör), képesekmegszabadítani őket a nem spórát hordozó mikroorganizmusoktól. A feldolgozási hőmérséklet mindössze 50-60 °C tizenöt-harminc percig. Egyes esetekben hideg sterilizálást alkalmaznak, amelyet szűrők vagy UV-sugárzás segítségével hajtanak végre.
A baktériumtenyésztési feltételek
A baktériumok növekedése és fejlődése csak bizonyos tényezők és ezek értékei mellett lehetséges:
1. Hőfok. A baktériumoknak három csoportja különbözik a hőmérsékleti preferenciákban:
- termofilek, vagyis hőszerető mikrobák 45-90°C-on szaporodnak, ami azt jelenti, hogy nem szaporodnak emberi és állati szervezetekben;
- a pszichofilek vagy a hideget kedvelő mikroorganizmusok az 5-15 °C közötti hőmérsékletet részesítik előnyben, és hűtőházakban termesztik;
- mezofilek, 25-37 °C hőmérsékleten fejlődnek, a baktériumok nagy részét magukban foglalják.
2. Könnyű. A fototróf baktériumok tenyésztésének sajátossága, mivel ezek végzik a fotoszintetikus folyamatot. De a legtöbb mikroba számára a világítás nem előfeltétel. És még fordítva is, a nap ultraibolya sugárzása elnyomhatja fejlődésüket.
3. Víz. Minden mikroorganizmusnak hozzáférhető (folyékony) vízre van szüksége. Ez az oka annak, hogy a fagyasztott élelmiszerben alig vagy egyáltalán nem szaporodnak a baktériumok.
4. A környezet savassága. A baktériumtenyésztés ezen elvét fent már részletesen tárgy altuk.
5. Levegőztetés. Az oxigén, mint kémiai elem, a víz szerves része, és számos vegyületet használnak felmikroorganizmusok tenyésztése. Gáz-halmazállapotú oxigént víz és más folyadékok is tartalmazhatnak oldott formában. A baktériumok jelentős részének állandó oxigénmolekulák ellátására van szüksége. De számos mikroorganizmus számára ez szükségtelen, vagy ami még rosszabb, a gáz halmazállapotú oxigén mérgező számukra, mivel nincs bennük kataláz és peroxidáz, amelyek elpusztítják a mérgező légúti termékeket. Ezért az anaerob baktériumok tenyésztésének legfontosabb lépése az O2 molekulák eltávolítása a tápközegből.
6. Mikroorganizmusok tenyésztése. Az aerob és anaerob baktériumok tenyésztése a környezet különböző rétegeiben és különböző módokon történik.
Aerob mikroorganizmusok tenyésztése
Az aerob baktériumok tenyésztéséhez molekuláris oxigénre van szükség. Az orvostudományban és az élelmiszeriparban sikeresen felhasználható tiszta aerob kultúrák előállításához a következő módszereket alkalmazzák:
- felületnövekedés sűrű közegben vagy folyékony közegben (vékony rétegükben), amikor az oxigén közvetlenül a levegőből érkezik;
- folyékony közegben történő mélytenyésztés, amikor a bennük oldott oxigén mennyiségének növelése állandó levegőztetéssel érhető el.
Anaerob mikroorganizmusok tenyésztése
Az ilyen típusú baktériumok tenyésztésének alapelve a minimális érintkezés a légköri oxigénnel. A növekedésük feltételeit sokkal nehezebb biztosítani, mint az aeroboknak. A következő módszereket használják az anaerobok izolálására a molekuláris O2:
- Fizikai. Az anaerob baktériumok tenyésztésének ez a módszere egy speciális vákuumberendezésben - egy mikroanaerosztátban - történő tenyésztésre korlátozódik. A benne lévő levegőt nitrogénből álló speciális gázkeverék helyettesíti 10% hidrogén és 5% szén-dioxid hozzáadásával.
- Vegyi. Ide tartoznak: abszorbeáló szerek használata (pl. Fe, Na2S2O4, CuCl) vagy redukálószerek (például aszkorbinsav).
- Biológiai. Ez az aerobok és anaerobok zárt rendszerben történő együttes termesztésére vezethető vissza. Ez a baktériumtenyésztési módszer abból áll, hogy a Petri-csésze egyik felét beoltják néhány aerob baktériumfajjal, a másik felét pedig a vizsgált anaerobbal. Fejlődése abban a pillanatban kezdődik, amikor az összes oxigén elfogy.
A következő vetési módszerek alkalmasak anaerob baktériumok tenyésztésére:
- a felületi rétegben;
- a steril paraffinnal töltött felületi rétegben;
- sűrű tápközeg sűrűjében;
- viszkózus közeg mély rétegeiben.
A tiszta kultúra megszerzése
A mikrobiológusok általában olyan mintákkal dolgoznak, amelyekben különböző típusú mikrobák élnek. A mikroorganizmusok (család, nemzetség, faj) szisztematikus helyzetének meghatározásához, valamint jellemzőik tanulmányozásához azonban el kell különíteni őket, és tiszta kultúrát kell termeszteni. Számos élelmiszeriparban nagy jelentőséggel bírnak, például sajt, kenyér, kvas, bor stb. gyártásában. A tejsavbaktériumok termesztése lehetővé teszinélkülözhetetlen alkotóeleme fermentált tejtermékek, tészta, kakaó, szilázs és még műanyag előállításának is.
A tiszta tenyészet sűrű tápközegben történő izolálásának módszere a mikroorganizmus-sejtek mechanikus elválasztásán és az azt követő izolált tenyésztésen alapul. A mintát steril térfogatú vízbe vagy sóoldatba helyezzük (10-100 ml), majd két percig rázatjuk. A vizsgált anyag (például kolbász vagy sajt) vastagságában elhelyezkedő mikroorganizmusok kinyeréséhez először a mintadarabokat steril eszközökkel homokkal dörzsöljük. Az előzetesen előkészített, 1 g tömegű vagy 1 ml térfogatú anyagot steril vízzel hígítjuk 10, 100, 1000 stb. A hígítás mértékét úgy kell megválasztani, hogy a sejtkoncentráció megfeleljen a módszer képességeinek.
A mikroorganizmusok utólagos tenyésztése a táptalaj előkészítése. Általában sűrű közeget (MPA) választanak. Először megolvasztjuk és 45-50 °C-ra hűtjük, majd csak ezután töltjük több Petri-csészébe (három-öt darab), amelyek aljára különböző koncentrációjú tamponokat helyezünk a vizsgált anyagból. Ezt követően a még nem fagyott táptalaj és az abba bevitt anyag összekeverését végezzük. Így rögzítik a sejteket a hordozó térfogatának különböző pontjain.
Ezután a Petri-csészéket termosztátba helyezzük 2 napra 22 °C-on. Ezalatt a sejtek olyan mértékben elszaporodnak, hogy az egyes sejtek által alkotott telep szabad szemmel is láthatóvá válik. Mindegyikük tiszta kultúra annak a baktériumtípusnak, amelynek sejtjeiből származikrózsa.
Ezt követően a Petri-csészékből a mikroorganizmusokat tápközeggel töltött külön kémcsövekbe tenyésztik ki. Ily módon vegyes mintából tiszta kultúrákat izolálnak. Ez a módszer a fejlesztőjének, R. Kochnak a nevét viseli. Csészemódszernek, vagy kimerítő vetésnek is szokták nevezni. Különböző típusú baktériumok tiszta tenyészeteinek kinyerése után meghatározzuk azok alakját, spóráit és családját.
Minden munkát az aszepszis elveinek megfelelően kell elvégezni. A mikroorganizmusok idő előtti fejlődésének elkerülése érdekében a vizsgálatot a mintavétel után azonnal el kell végezni. A csapvizet az első adagok leeresztése után elemzik, mivel ezek a csövekben és csapokban felhalmozódott mikrobákat tartalmazhatnak. A gyümölcsök, bogyók és zöldségek mikroflórája főként a felszínen (héján) található, ezért a lemosást róla végezzük. Ehhez helyezze a magzatot egy steril edénybe, és töltse fel a szükséges mennyiségű vízzel. Ezután erősen összerázzuk, és a vizet egy másik edénybe öntjük. A ruhatermékekből származó termést is tamponként nyerik ki, de előtte adott méretű darabokat vágnak ki belőlük.
