A molekuláris biológiai kutatási módszerek nagy szerepet játszanak a modern orvostudományban, a törvényszéki orvostudományban és a biológiában. A DNS- és RNS-tanulmányozás fejlődésének köszönhetően egy személy képes tanulmányozni egy szervezet genomját, meghatározni a betegség kórokozóját, felismerni a kívánt nukleinsavat savak keverékében stb.
Molekuláris biológiai kutatási módszerek. Mi az?
A 70-es és 80-as években a tudósoknak először sikerült megfejteni az emberi genomot. Ez az esemény lendületet adott a géntechnológia és a molekuláris biológia fejlődésének. A DNS és az RNS tulajdonságainak tanulmányozása arra a tényre vezetett, hogy ezek a nukleinsavak ma már felhasználhatók betegségek diagnosztizálására, gének tanulmányozására.
DNS és RNS beszerzése
A molekuláris biológiai diagnosztikai módszerek megkövetelik a kiindulási anyag jelenlétét: gyakrabban nukleinsavak. Számos módja van ezeknek az anyagoknak az élő szervezetek sejtjeiből történő izolálására. Mindegyiknek megvannak a maga előnyei és hátrányai, és ez szükségesvegye figyelembe a tiszta nukleinsavak izolálására szolgáló módszer kiválasztásakor.
1. DNS beszerzése Marmur szerint. A módszer abból áll, hogy anyagok keverékét alkohollal kezelik, aminek eredményeként a tiszta DNS kicsapódik. Ennek a módszernek a hátránya az agresszív anyagok használata: fenol és kloroform.
2. A DNS izolálása Boom szerint. Az itt használt fő anyag a guanidin-tiocianát (GuSCN). Hozzájárul a dezoxiribonukleinsav speciális szubsztrátokon történő kicsapódásához, ahonnan ezt követően speciális pufferrel össze lehet gyűjteni. A GuSCN azonban a PTC inhibitora, és még a kicsapott DNS-be kerülő kis része is befolyásolhatja a polimeráz láncreakció lefolyását, ami fontos szerepet játszik a nukleinsavakkal való munkában.
3. A szennyeződések ülepedése. A módszer abban különbözik a korábbiaktól, hogy nem a dezoxiribonukleinsav molekulái válnak ki, hanem a szennyeződések. Ehhez ioncserélőket használnak. Hátránya, hogy nem minden anyag tud kicsapódni.
4. Tömeges vetítés. Ezt a módszert olyan esetekben alkalmazzák, amikor nincs szükség pontos információra a DNS-molekula összetételéről, de szükséges néhány statisztikai adat beszerzése. Ez azzal magyarázható, hogy a nukleinsav szerkezete károsodhat, ha detergensekkel, különösen lúgokkal kezelik.
Kutatási módszerek osztályozása
Minden molekuláris biológiai kutatási módszer három nagy csoportra osztható:
1. Amplifikáció (sok enzim felhasználásával). IttA PCR - polimeráz láncreakcióra utal, amely számos diagnosztikai módszerben nagy szerepet játszik.
2. Nem erősítő. Ez a módszercsoport közvetlenül kapcsolódik a nukleinsavkeverékek működéséhez. Példák: 3 blot, in situ hibridizáció stb.
3. Egy adott próba DNS-hez vagy RNS-hez kötődő próbamolekulából származó jel felismerésén alapuló módszerek. Példa erre a hibrid rögzítési rendszer (hc2).
A molekuláris biológiai kutatási módszerekben használható enzimek
Sok molekuláris diagnosztikai módszer magában foglalja az enzimek széles skálájának használatát. Az alábbiakban a leggyakrabban használt:
1. Restrikciós enzim – „felvágja” a DNS-molekulát a szükséges részekre.
2. DNS polimeráz – kétszálú dezoxiribonukleinsav molekulát szintetizál.
3. Reverz transzkriptáz (revertáz) – DNS szintetizálására használják RNS-templáton.
4. DNS-ligáz – a nukleotidok közötti foszfodiészter kötések kialakításáért felelős.
5. Exonukleáz – eltávolítja a nukleotidokat a dezoxiribonukleinsav molekula terminális szakaszairól.
A PCR a DNS-amplifikáció fő módszere
A polimeráz láncreakciót (PCR) aktívan használják a modern molekuláris biológiában. Ez egy olyan módszer, amellyel egyetlen DNS-molekuláról hatalmas számú másolat nyerhető (a molekulák amplifikálódnak).
A PCR fő funkciói:
- diagnosztikabetegségek;
- DNS-szakaszok, gének klónozása.
A következő elemek szükségesek a polimeráz láncreakció végrehajtásához: a kezdeti DNS-molekula, egy hőstabil DNS-polimeráz (Taq vagy Pfu), dezoxiribonukleotid-foszfátok (nitrogéntartalmú bázisok forrásai), primerek (2 primer 1 DNS-molekulánként) és magát a pufferrendszert, amelyben minden reakció lehetséges.
A PCR három lépésből áll: denaturáció, primer annealing és elongáció.
1. Denaturáció. 94-95 Celsius fokos hőmérsékleten a hidrogénkötések a DNS két szála között megszakadnak, és ennek eredményeként két egyszálú molekulát kapunk.
2. Primer lágyítás. 50-60 Celsius fokos hőmérsékleten a primerek a komplementaritás szerint kapcsolódnak az egyszálú nukleinsavmolekulák végéhez.
3. Megnyúlás. 72 fokos hőmérsékleten a dezoxiribonukleinsav kétszálú leánymolekuláinak szintézise megy végbe.
DNS-szekvenálás
A molekuláris biológiai kutatási módszerek gyakran megkövetelik a dezoxiribonukleinsav molekula nukleotidszekvenciájának ismeretét. A genetikai kód meghatározására szekvenálást végeznek. A jövő molekuláris diagnosztikája az emberi szekvenálásból nyert ismereteken fog alapulni.
A következő típusú sorrendet különböztetjük meg:
- Maxam-Gilbert szekvenálás;
- Sanger szekvenálás;
- piroszekvenálás;
- nanoporeszekvenálás.
