Az immobilizált enzimek fogalma először a 20. század második felében jelent meg. Eközben 1916-ban azt találták, hogy a szénre szorbeált szacharóz megőrizte katalitikus aktivitását. 1953-ban D. Schleit és N. Grubhofer végrehajtotta a pepszin, amiláz, karboxipeptidáz és RNáz első megkötését oldhatatlan hordozóval. Az immobilizált enzimek fogalmát 1971-ben legalizálták. Ez történt az első mérnöki enzimológiai konferencián. Jelenleg az immobilizált enzimek fogalmát tágabb értelemben értelmezik, mint a 20. század végén. Nézzük meg közelebbről ezt a kategóriát.
Általános információ
Az immobilizált enzimek olyan vegyületek, amelyek mesterségesen kötődnek egy oldhatatlan hordozóhoz. Katalitikus tulajdonságaikat azonban megőrzik. Jelenleg ezt a folyamatot két szempontból vizsgáljuk – a fehérjemolekulák mozgásszabadságának részleges és teljes korlátozása keretében.
Méltóság
A tudósok megállapították az immobilizált enzimek bizonyos előnyeit. Heterogén katalizátorként működve könnyen elválaszthatók a reakcióközegtől. A kutatás részeként kiderült, hogy az immobilizált enzimek alkalmazása megismételhető. A kötési folyamat során a kapcsolatok megváltoztatják tulajdonságaikat. Megszerzik a szubsztrát specifitását és stabilitását. Ugyanakkor tevékenységük a környezeti feltételektől kezd függeni. Az immobilizált enzimek tartósak és nagyfokú stabilitást mutatnak. Ez ezerszer, tízezerszer nagyobb, mint például a szabad enzimeké. Mindez biztosítja az immobilizált enzimeket tartalmazó technológiák magas hatékonyságát, versenyképességét és gazdaságosságát.
Média
J. Poratu azonosította az immobilizáláshoz használható ideális anyagok kulcsfontosságú tulajdonságait. A hordozóknak rendelkezniük kell:
- Feloldhatatlanság.
- Magas biológiai és kémiai ellenállás.
- A gyors aktiválás képessége. A hordozóknak könnyen reaktívvá kell válniuk.
- Jelentős hidrofilitás.
- Szükséges áteresztőképesség. Indikátorának egyformán elfogadhatónak kell lennie mind az enzimek, mind a koenzimek, a reakciótermékek és a szubsztrátok esetében.
Jelenleg nincs olyan anyag, amely teljes mértékben megfelelne ezeknek a követelményeknek. Ennek ellenére a gyakorlatban olyan hordozókat használnak, amelyek alkalmasak az immobilizálásra.bizonyos kategóriájú enzimek meghatározott körülmények között.
Osztályozás
Az anyagok, amelyek kapcsán a vegyületek immobilizált enzimekké alakulnak, jellegüktől függően szervetlen és szerves anyagokra oszthatók. Számos vegyület megkötése polimer hordozóanyagokkal történik. Ezek a szerves anyagok 2 osztályba sorolhatók: szintetikus és természetes. Mindegyikben a szerkezettől függően csoportokat különböztetnek meg. A szervetlen hordozóanyagokat elsősorban az üvegből, kerámiából, agyagból, szilikagélből és grafitfeketéből készült anyagok képviselik. Anyagokkal végzett munka során a száraz kémiai módszerek népszerűek. Az immobilizált enzimeket úgy állítják elő, hogy a hordozóanyagokat titán-, alumínium-, cirkónium-, hafnium-oxid-filmmel vonják be, vagy szerves polimerekkel dolgozzák fel. Az anyagok egyik fontos előnye a könnyű regenerálhatóság.
Fehérjehordozók
A legnépszerűbbek a lipid-, poliszacharid- és fehérjeanyagok. Ez utóbbiak közül érdemes kiemelni a szerkezeti polimereket. Ezek elsősorban a kollagén, a fibrin, a keratin és a zselatin. Az ilyen fehérjék széles körben elterjedtek a természetes környezetben. Megfizethetőek és gazdaságosak. Ezenkívül nagyszámú funkciós csoportjuk van a kötéshez. A fehérjék biológiailag lebomlanak. Ez lehetővé teszi az immobilizált enzimek alkalmazásának kiterjesztését az orvostudományban. Eközben a fehérjék negatív tulajdonságokkal is rendelkeznek. Az immobilizált enzimek fehérjehordozókon történő alkalmazásának hátránya az utóbbiak magas immunogenitása, valamintaz a képesség, hogy ezeknek csak bizonyos csoportjait vigyük be a reakciókba.
Poliszacharidok, aminoszacharidok
Ezen anyagok közül a kitint, dextránt, cellulózt, agarózt és származékait használják leggyakrabban. A poliszacharidok reakciókkal szembeni ellenállóbbá tétele érdekében lineáris láncaikat epiklórhidrinnel térhálósítják. Különféle ionogén csoportok szabadon bekerülhetnek a hálózati struktúrákba. A kitin nagy mennyiségben halmozódik fel hulladékként a garnélarák és rákok ipari feldolgozása során. Ez az anyag vegyszerálló, és jól meghatározott porózus szerkezettel rendelkezik.
Szintetikus polimerek
Ez az anyagcsoport nagyon változatos és hozzáférhető. Ide tartoznak az akrilsav, sztirol, polivinil-alkohol, poliuretán és poliamid polimerek. Legtöbbjük mechanikailag erős. Az átalakulás során lehetőséget adnak a pórusméret meglehetősen széles tartományon belüli változtatására, különféle funkciós csoportok bevezetésére.
Kötési módok
Jelenleg két alapvetően eltérő lehetőség van az immobilizálásra. Az első a hordozóanyaggal kovalens kötés nélküli vegyületek előállítása. Ez a módszer fizikai. Egy másik lehetőség kovalens kötés kialakulását jelenti az anyaggal. Ez egy kémiai módszer.
Adszorpció
Segítségével immobilizált enzimeket nyerünk úgy, hogy a gyógyszert a hordozó felületén tartjákdiszperziós, hidrofób, elektrosztatikus kölcsönhatások és hidrogénkötések. Az adszorpció volt az első módja annak, hogy korlátozzák az elemek mobilitását. Ez a lehetőség azonban még most sem veszítette el jelentőségét. Ezenkívül az adszorpciót tartják a legelterjedtebb immobilizálási módszernek az iparban.
A módszer jellemzői
Tudományos publikációk több mint 70 adszorpciós módszerrel nyert enzimet írnak le. A hordozók főleg porózus üveg, különféle agyagok, poliszacharidok, alumínium-oxidok, szintetikus polimerek, titán és más fémek voltak. Ez utóbbiak a leggyakrabban használtak. A gyógyszer hordozón való adszorpciójának hatékonyságát az anyag porozitása és a fajlagos felület határozza meg.
Hatásmechanizmus
Az enzimek adszorpciója oldhatatlan anyagokon egyszerű. Ezt úgy érik el, hogy a gyógyszer vizes oldatát érintkezésbe hozza a hordozóval. Ez áthaladhat statikusan vagy dinamikusan. Az enzimoldatot friss üledékkel, például titán-hidroxiddal keverjük össze. A vegyületet ezután enyhe körülmények között szárítjuk. Az ilyen immobilizálás során az enzimaktivitás csaknem 100%-ban megmarad. Ugyanakkor a fajlagos koncentráció eléri a 64 mg/g hordozót.
Negatív pillanatok
Az adszorpció hátrányai közé tartozik az enzim és a hordozó megkötésének alacsony erőssége. A reakciókörülmények megváltoztatása során elemvesztés, a termékek szennyeződése és fehérje deszorpciója figyelhető meg. Az erő javításárakötőhordozók előre módosítottak. Az anyagokat különösen fémionokkal, polimerekkel, hidrofób vegyületekkel és más többfunkciós szerekkel kezelik. Egyes esetekben maga a gyógyszer is módosul. Ez azonban gyakran tevékenységének csökkenéséhez vezet.
Gélbe helyezés
Ez az opció egyedisége és egyszerűsége miatt meglehetősen gyakori. Ez a módszer nem csak egyes elemekre, hanem több enzimből álló komplexekre is alkalmas. A gélbe való bedolgozás kétféleképpen történhet. Az első esetben a gyógyszert a monomer vizes oldatával kombinálják, majd polimerizációt hajtanak végre. Ennek eredményeként egy térbeli gélstruktúra jelenik meg, amely enzimmolekulákat tartalmaz a sejtekben. A második esetben a gyógyszert a kész polimer oldatába visszük be. Ezután gél állapotba kerül.
Behatolás áttetsző szerkezetekbe
Ennek az immobilizálási módszernek a lényege egy vizes enzimoldat elválasztása a szubsztráttól. Ehhez egy félig áteresztő membránt használnak. Lehetővé teszi a kofaktorok és szubsztrátok kis molekulatömegű elemeinek átjutását, és megtartja az enzimek nagy molekuláit.
Mikrokapszulázás
Több lehetőség van az áttetsző szerkezetekbe való beágyazásra. Ezek közül a mikrokapszulázás és a fehérjék liposzómákba történő beépítése a legnagyobb érdeklődésre számot tartó. Az első lehetőséget T. Chang javasolta 1964-ben. Abból áll, hogy az enzimoldatot egy zárt kapszulába juttatják, amelynek falai félig áteresztő anyagból készülnek.polimer. A membrán megjelenését a felületen a vegyületek határfelületi polikondenzációjának reakciója okozza. Egyikük feloldódik a szerves, a másik pedig a vizes fázisban. Ilyen például a szebacinsav-halogenid (szerves fázis) és hexametilén-diamin-1,6 (illetve vizes fázis) polikondenzációjával kapott mikrokapszula kialakítása. A membrán vastagságát századmikrométerben számítják ki. A kapszulák mérete több száz vagy tíz mikrométer.
Beépülés a liposzómákba
Ez az immobilizálási módszer közel áll a mikrokapszulázáshoz. A liposzómák lamelláris vagy gömb alakú lipid kettősréteg-rendszerekben jelennek meg. Ezt a módszert először 1970-ben használták. A liposzómák lipidoldatból történő izolálásához a szerves oldószert elpárologtatják. A megmaradt vékony filmet vizes oldatban diszpergáljuk, amelyben az enzim jelen van. E folyamat során a lipid kettősrétegű struktúrák önszerveződése megy végbe. Az ilyen immobilizált enzimek meglehetősen népszerűek az orvostudományban. Ez annak a ténynek köszönhető, hogy a molekulák többsége a biológiai membránok lipidmátrixában lokalizálódik. A liposzómákban található immobilizált enzimek az orvostudomány legfontosabb kutatási anyagai, amelyek lehetővé teszik a létfontosságú folyamatok mintázatainak tanulmányozását és leírását.
Új kötvények kialakulása
Az ipari biokatalizátorok előállításának legelterjedtebb módszere az enzimek és hordozók közötti új kovalens láncok kialakításával történő immobilizálás.rendeltetési hely. A fizikai módszerekkel ellentétben ez az opció visszafordíthatatlan és erős kötést biztosít a molekula és az anyag között. Kialakulását gyakran gyógyszerstabilizáció kíséri. Ugyanakkor az enzim elhelyezkedése a hordozóhoz képest az 1. kovalens kötés távolságában bizonyos nehézségeket okoz a katalitikus folyamat megvalósításában. A molekulát egy betét segítségével választják el az anyagtól. Gyakran használják poli- és bifunkciós szerként. Ezek különösen a hidrazin, cián-bromid, glutársav-dialhedrid, szulfuril-klorid stb. Például a galaktozil-transzferáz eltávolításához a következő szekvenciát illesztjük a hordozó és az enzim közé -CH2- NH-(CH 2)5-CO-. Ilyen helyzetben egy inszert, egy molekula és egy hordozó van jelen a szerkezetben. Mindegyiket kovalens kötés köti össze. Alapvető jelentőségű, hogy a reakcióba olyan funkciós csoportokat kell bevinni, amelyek nem lényegesek az elem katalitikus funkciójához. Tehát a glikoproteinek általában nem a fehérjén, hanem a szénhidrát részen keresztül kapcsolódnak a hordozóhoz. Ennek eredményeként stabilabb és aktívabb immobilizált enzimeket kapunk.
Cellák
A fent leírt módszerek univerzálisnak tekinthetők minden típusú biokatalizátor esetében. Ide tartoznak többek között a sejtek, szubcelluláris struktúrák, amelyek immobilizálása az utóbbi időben elterjedtté vált. Ennek oka a következő. Amikor a sejteket immobilizálják, nincs szükség az enzimkészítmények izolálására és tisztítására, vagy kofaktorok beépítésére a reakciókba. Ennek eredményeként lehetségessé válikolyan rendszerek, amelyek többlépcsős folyamatos folyamatokat hajtanak végre.
Rögzített enzimek használata
Az állatgyógyászatban, az iparban és más gazdasági ágazatokban a fenti módszerekkel előállított gyógyszerek meglehetősen népszerűek. A gyakorlatban kidolgozott megközelítések megoldást adnak a szervezetben történő célzott gyógyszerbejuttatás problémáira. Az immobilizált enzimek lehetővé tették minimális allergén és toxicitású, elnyújtott hatású gyógyszerek előállítását. Jelenleg a tudósok mikrobiológiai megközelítésekkel oldják meg a tömeg és az energia biokonverziójával kapcsolatos problémákat. Eközben az immobilizált enzimek technológiája is jelentősen hozzájárul a munkához. A fejlődés kilátásai meglehetősen szélesnek tűnnek. Így a jövőben a környezet állapotának monitorozásának folyamatában az egyik kulcsszerep az új típusú elemzésekhez kell, hogy tartozzon. Különösen biolumineszcens és enzimes immunoassay módszerekről beszélünk. A fejlett megközelítések különösen fontosak a lignocellulóz alapanyagok feldolgozásában. Az immobilizált enzimek gyenge jelerősítőkként használhatók. Az aktív centrum ultrahangnak, mechanikai igénybevételnek vagy fitokémiai átalakulásnak kitett hordozó hatása alatt állhat.
