Mi áll a DNS-hibridizáció hátterében? Bár a kettős szálú DNS-szekvencia fiziológiás körülmények között általában stabil, e feltételek laboratóriumi megváltoztatása (jellemzően a környezeti hőmérséklet emelésével) a molekulák egyedi szálakká válását eredményezi. Ez utóbbiak kiegészítik egymást, de kiegészíthetik a környezetükben jelen lévő más szekvenciákat is. A környezeti hőmérséklet csökkentése lehetővé teszi, hogy az egyszálú molekulák egymáshoz illeszkedjenek vagy "hibridizálódjanak". Ez a DNS-hibridizációs módszer.
A koncepció a molekuláris biológia szemszögéből
A DNS-replikációban és a DNS RNS-vé történő átírásában egyaránt részt vevő tudósok nukleotid-keresztezésekre és molekuláris biológiai technikákra támaszkodnak. Ide tartozik a Southern és Northern blot, a polimeráz láncreakció (PCR), valamint a legtöbb DNS-RNS hibridizációs és szekvenálási megközelítés.
Alkalmazás
A hibridizáció a nukleotid fő tulajdonságaszekvenciákat, és a molekuláris biológia számos módszerében használják. Két faj általános genetikai kapcsolata meghatározható DNS-szakaszok hibridizálásával (DNS-DNS hibridizáció). A közeli rokon élőlények közötti szekvencia-hasonlóságok miatt az ilyen DNS-hibridek megolvadásához magasabb hőmérsékletre van szükség, mint a távolabbi organizmusokhoz. Különféle módszerek hibridizációt alkalmaznak a DNS-minta eredetének meghatározására, beleértve a polimeráz láncreakciót (PCR). Egy másik módszer szerint a rövid DNS-szekvenciákat sejt mRNS-hez hibridizálják, hogy azonosítsák az expresszált géneket. A gyógyszergyárak az antiszensz RNS felhasználását vizsgálják a nem kívánt mRNS-hez való kötődésre, megakadályozva, hogy a riboszóma mRNS-t fehérjévé alakítson.
DNS-DNS hibridizáció általában olyan molekuláris biológiai technikára vonatkozik, amely a DNS-szekvenciák csoportjai közötti genetikai hasonlóság mértékét méri. Általában két szervezet közötti genetikai távolság meghatározására használják. Széles körben használták a filogeneziában és a taxonómiában.
Módszertan
Az egyik szervezet DNS-ét megjelölték, majd összekeverték jelöletlen DNS-sel, amely összehasonlítható volt vele. Az elegyet inkubáljuk, hogy a DNS-szálak disszociálódjanak, majd lehűtjük, így regenerált hibrid kettősszálú DNS-t kapunk. A nagy hasonlósággal rendelkező hibridizált szekvenciák szorosabban kötődnek, és több energiát igényelnek az elválasztásukhoz: azaz elválik, ha magasabb hőmérsékleten hevítik.hőmérséklet, mint a különböző szekvenciák, ez a folyamat „DNS-olvadásként” ismert.
DNS-olvadás
A hibridizált DNS olvadási profilját értékelve a kettős szálú DNS-t egy úgynevezett "oszlophoz" kötjük, és a kapott keveréket felmelegítjük. Minden lépésben az oszlopot mossuk, és az olvadó DNS-szekvenciák egyszálúvá válnak, és lemossuk az oszlopról. Azok a hőmérsékletek, amelyeken a jelölt DNS kilép az oszlopból, a szekvenciák közötti hasonlóság mértékét tükrözi (és az önhajtorodó minta kontrollként szolgál). Ezeket az eredményeket kombinálják az élőlények közötti genetikai hasonlóság mértékének meghatározására. A modern mikrobiológia szerint a DNS-hibridizáció lehetetlen ezeknek a dolgoknak a megértése nélkül.
Ha több ribonukleinsav (vagy dezoxiribonukleinsav) fajt hasonlítunk össze ilyen módon, a hasonlósági értékek lehetővé teszik, hogy a fajt a filogenetikai fába helyezzük. Ezért ez az egyik lehetséges megközelítés a molekuláris szisztematika lefolytatására. Charles Sibley és John Ahlquist, ennek a technikának az úttörői, DNS-DNS hibridizációt használtak a madarak (Sibley-Ahlquist taxonómia) és a főemlősök filogenetikai kapcsolatainak tanulmányozására.
A biológia fontossága
A DNS-DNS hibridizáció a baktériumfajok megkülönböztetésének aranystandardja, több mint 70%-os hasonlósági értékkel, ami azt jelzi, hogy az összehasonlított törzsek különböző fajokhoz tartoznak. 2014-ben 79%-os hasonlósági küszöböt javasoltak egy baktérium alfaj elkülönítésére.
A kritikusok azt állítják, hogy ez a technika pontatlan a közeli rokon fajok összehasonlítására, mivel az élőlények közötti ortológ szekvenciák közötti különbségek mérésére tett kísérleteket túlterheli a paralóg megfelelők hibridizációja az organizmus genomjában. A DNS-szekvenálás és a számítógépes szekvencia-összehasonlítás jelenleg a genetikai távolság meghatározásának általánosan használt módszere, bár ezt a megközelítést a mikrobiológiában még mindig használják a baktériumok azonosítására.
A jelenlegi módszer a DNS-DNS hibridizáció végrehajtása szilikonban, teljesen vagy részben szekvenált genomokkal. A DSMZ által kifejlesztett GGDC a legpontosabb ismert eszköz a DDH-szerű értékek kiszámítására. Más algoritmikus fejlesztések mellett megoldja a paralóg szekvenciákkal kapcsolatos problémát azáltal, hogy gondosan kiszűri őket a két genomszekvencia közötti egyezésekből.
FISH-módszer
A fluoreszcencia in situ hibridizáció (FISH) egy laboratóriumi technika, amelyet DNS kimutatására és szekvenálására használnak, gyakran egy adott kromoszómán.
1969-ben Joseph Gall és Mary Lou Pardu publikált egy tanulmányt, amely bemutatja, hogy egy riboszómális DNS-szekvencia radioaktív másolatai felhasználhatók komplementer DNS-szekvenciák kimutatására a békatojás magjában. Ezen eredeti megfigyelések óta számos finomítás növelte a sokoldalúságot ésaz eljárás olyan mértékű érzékenysége, hogy az in situ hibridizációt ("helyben", latinul) ma már a citogenetika fontos eszközének tekintik. (Az in situ kifejezést ma már a karcinóma növekedésének kezdeti szakaszára is használják, amikor csak a hámszövet vesz részt a kóros folyamatban.)
Fluoreszcens hibridizációs szekvencia
RNS-próbák megtervezhetők bármely génhez vagy a génen belüli bármely szekvenciához az lncRNS és miRNS mRNS szövetekben és sejtekben történő megjelenítésére. A FISH-t a sejtek szaporodási ciklusának tanulmányozására használják, különös tekintettel a nukleáris interfázisra bármilyen kromoszóma-rendellenesség esetén. A FISH lehetővé teszi az archív esetek nagy sorozatának elemzését, sokkal könnyebb azonosítani az azonosított kromoszómát egy olyan mesterséges kromoszómabázissal rendelkező szonda létrehozásával, amely hasonló kromoszómákat vonz.
Hibridizációs jelek minden próbához, ha magrendellenességet észlelnek: minden mRNS és lncRNS detektáló próba 20 pár oligonukleotidból áll, mindegyik pár 40-50 bp méretű teret fed le. p. A szondák szabadalmaztatott kémiát használnak az mRNS kimutatására.
Hibridizálás DNS-próbákkal
A próbákat gyakran olyan DNS-fragmensekből állítják elő, amelyeket izoláltak, tisztítottak és amplifikáltak, hogy felhasználják az emberi genom tervezésében. Az emberi genom mérete a közvetlenül szekvenálható hosszhoz képest olyan nagy, hogy fel kell osztani.töredékek. Végül ezeket a fragmentumokat úgy rendezték el, hogy az egyes fragmensek egy másolatát még kisebb egységekre emésztették szekvencia-specifikus endonukleázok segítségével, hogy megmérjék az egyes kis fragmentumok méretét méretkizárásos kromatográfiával, ezen információk alapján annak meghatározására, hogy a nagy fragmensek hol fedtek át egymást.
Az elemek egyedi DNS-szekvenciájának megőrzése érdekében a fragmentumokat egy folyamatosan ismétlődő baktériumpopulációk rendszeréhez adtuk. A baktériumok klonális populációit, amelyek mindegyike egyetlen mesterséges kromoszómát tart fenn, a világ különböző laboratóriumaiban tárolják. A mesterséges kromoszómák (BAC) bármely könyvtárral rendelkező laboratóriumban termeszthetők, extrahálhatók és jelölhetők. A genomikus könyvtárakat gyakran azokról az intézményekről nevezték el, ahol kidolgozták őket. Példa erre az RPCI-11 könyvtár, amelyet a buffaloi Roswell Cancer Institute-ról (New York, USA) neveztek el. Ezek a fragmentumok körülbelül 100 ezer bázispárt alkotnak, és a legtöbb FISH-szonda alapját képezik.
