A fény abszorpciója és további visszabocsátása szervetlen és szerves közegek által a foszforeszcencia vagy fluoreszcencia eredménye. A jelenségek közötti különbség a fényelnyelés és a sugárkibocsátás közötti intervallum hossza. A fluoreszcenciánál ezek a folyamatok szinte egyidejűleg, a foszforeszcenciánál pedig némi késéssel mennek végbe.
Történelmi háttér
1852-ben Stokes brit tudós írta le először a fluoreszcenciát. Az új kifejezést a fluorpáttal végzett kísérletei eredményeként alkotta meg, amely ultraibolya fény hatására vörös fényt bocsátott ki. Stokes felfigyelt egy érdekes jelenségre. Megállapította, hogy a fluoreszkáló fény hullámhossza mindig hosszabb, mint a gerjesztő fényé.
A 19. században számos kísérletet végeztek a hipotézis megerősítésére. Kimutatták, hogy számos minta fluoreszkál, ha ultraibolya fénynek vannak kitéve. Az anyagok között szerepeltek többek között kristályok, gyanták, ásványok, klorofill,gyógyászati alapanyagok, szervetlen vegyületek, vitaminok, olajok. A színezékek biológiai elemzéshez való közvetlen felhasználása csak 1930-ban kezdődött
Fluoreszcens mikroszkópos leírás
A 20. század első felében a kutatás során felhasznált anyagok egy része nagyon specifikus volt. A kontrasztos módszerekkel nem elérhető indikátoroknak köszönhetően a fluoreszcens mikroszkópos módszer mind az orvosbiológiai, mind a biológiai kutatások fontos eszközévé vált. A kapott eredmények nem kis jelentőséggel bírtak az anyagtudomány számára.
Milyen előnyei vannak a fluoreszcens mikroszkópiának? Az új anyagok segítségével lehetővé vált rendkívül specifikus sejtek és szubmikroszkópos komponensek izolálása. A fluoreszcens mikroszkóp lehetővé teszi az egyes molekulák kimutatását. A különféle színezékek lehetővé teszik több elem egyidejű azonosítását. Bár a berendezés térbeli felbontását korlátozza a diffrakciós határ, ami viszont a minta specifikus tulajdonságaitól függ, az e szint alatti molekulák kimutatása is teljesen lehetséges. Különféle minták autofluoreszcenciát mutatnak besugárzás után. Ezt a jelenséget széles körben használják a kőzettan, botanikában és félvezetőiparban.
Jellemzők
Az állati szövetek vagy patogén mikroorganizmusok vizsgálatát gyakran bonyolítja vagy túl gyenge vagy nagyon erős nem specifikus autofluoreszcencia. Az érték azonban ina kutatás egy meghatározott hullámhosszon gerjesztett és a kívánt intenzitású fényáramot kibocsátó komponensek bejuttatására tesz szert az anyagba. A fluorokrómok színezékként működnek, amelyek képesek önmegkötődni a szerkezetekhez (láthatatlan vagy látható). Ugyanakkor a célpontok és a kvantumhozam tekintetében nagy szelektivitás jellemzi őket.
A fluoreszcens mikroszkópia a természetes és szintetikus színezékek megjelenésével széles körben elterjedt. Specifikus emissziós és gerjesztési intenzitási profillal rendelkeztek, és meghatározott biológiai célpontokra irányultak.
Egyedi molekulák azonosítása
Gyakran ideális körülmények között egyetlen elem izzását is regisztrálhatja. Ehhez többek között kellően alacsony detektorzaj és optikai háttér biztosítása szükséges. Egy fluoreszcein molekula akár 300 000 fotont is kibocsáthat, mielőtt a fényfehérítés következtében megsemmisülne. 20%-os begyűjtési aránnyal és folyamathatékonysággal kb 60 ezer értékben regisztrálhatók
A lavina fotodiódákon vagy elektronszaporodáson alapuló fluoreszcens mikroszkópia lehetővé tette a kutatók számára az egyes molekulák viselkedésének megfigyelését másodpercekig, bizonyos esetekben percekig.
Nehézségek
A fő probléma az optikai háttér zajelnyomása. Tekintettel arra a tényre, hogy a szűrők és lencsék felépítéséhez használt anyagok közül sok némi autofluoreszcenciát mutat, a tudósok erőfeszítései a kezdeti szakaszban a kibocsátásra összpontosultak.alacsony fluoreszcenciájú komponensek. A későbbi kísérletek azonban új következtetésekhez vezettek. Különösen a teljes belső visszaverődésen alapuló fluoreszcens mikroszkóppal találták alacsony háttér- és nagy gerjesztésű fénykibocsátást.
Mechanizmus
A teljes belső visszaverődésen alapuló fluoreszcens mikroszkópia alapelve a gyorsan bomló vagy nem terjedő hullám alkalmazása. Különböző törésmutatójú közegek interfészén keletkezik. Ebben az esetben a fénysugár egy prizmán halad át. Magas törésmutatója van.
A prizma egy vizes oldat vagy alacsony paraméterű üveg mellett van. Ha a fénysugarat a kritikusnál nagyobb szögben irányítják rá, a sugár teljesen visszaverődik a határfelületről. Ez a jelenség viszont nem terjedő hullámot eredményez. Más szavakkal, olyan elektromágneses tér jön létre, amely 200 nanométernél kisebb távolságból áthatol egy alacsonyabb törésmutatójú közegbe.
Nem terjedő hullámban a fény intenzitása elég lesz a fluoroforok gerjesztéséhez. Kivételesen sekély mélysége miatt azonban térfogata nagyon kicsi lesz. Az eredmény egy alacsony szintű háttér.
Módosítás
A teljes belső visszaverődésen alapuló fluoreszcens mikroszkópia epi-megvilágítással megvalósítható. Ehhez megnövelt numerikus rekesznyílású objektívekre van szükség (legalább 1,4, de kívánatos, hogy elérje az 1,45-1,6-ot), valamint a készülék részben megvilágított mezőjére. Ez utóbbit kis folttal érjük el. A nagyobb egyenletesség érdekében vékony gyűrűt használnak, amelyen keresztül az áramlás egy része blokkolva van. Egy olyan kritikus szög eléréséhez, amely után teljes visszaverődés következik be, a lencsékben és a mikroszkóp fedőüvegében lévő merülő közeg nagy törésszintje szükséges.
