A Gram festést széles körben használják a mikrobiológiában, mivel ez az egyik legegyszerűbb módja a baktériumok sejtfaluk összetétele alapján történő megkülönböztetésének. Gram szerint minden baktérium Gram-pozitívra (Gram (+)) és Gram-negatívra (Gram (-)) osztható. A Gram-festési módszert 1884-ben fejlesztették ki, és azóta sem veszített népszerűségéből, bár többször módosították.
Sejtfal szerkezete
A Gram-festés megmutatja, hogy egy baktérium Gram-pozitív vagy Gram-negatív-e. A baktériumok Gram-re (+) és Gram-ra (-) való osztódása a sejtfaluk szerkezetének megfelelően történik.
A sejtfal tartalmazza a legnagyobb mennyiségben peptidoglikánt (mureint) – egy összetett anyagot, amely magában foglalja a peptapeptidet és a glikánt is. A glikán N-acetil-glükózamin és N-acetil-muraminsav váltakozó maradékaiból áll, amelyek β-1-gyel kapcsolódnak egymáshoz,4-glikozidos kötések. A peptidoglikán biztosítja a sejtforma fenntartását, az ozmotikus védelmet és az antigén funkciókat.
Fő különbségek a Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok között
A különböző baktériumoknak eltérő a peptidoglikán rétegvastagsága. A Gram-pozitívnak minősített baktériumoknál 15-80 nm, míg a Gram-negatívoknál 2-8 nm. Ugyanakkor a Gram-negatív baktériumok speciális szerkezettel rendelkeznek a peptidoglikán réteg alatt, ami a Gram-pozitív baktériumoknak nincs - a periplazmatikus tér. Ez a tér tele van hidrolitikus enzimekkel - β-laktamáz, ribonukleáz 1, foszfatáz. Ezek az enzimek felelősek a Gram-negatív baktériumok számos antibiotikummal szembeni rezisztenciájáért.
A baktériumok Gram(-) peptidoglikán rétege lipopoliszacharidhoz, egy endotoxint tartalmazó antigén szerkezethez kötődik. A Gram(+) baktériumokban a teichoinsavak hasonló funkciókat látnak el.
A Gram-negatív baktériumoknak van egy további szerkezete – a külső membrán.
A festési módszer lényege
A festés megkezdése előtt elkészítjük a vizsgált baktériumok kenetét. Ehhez vizet csepegtetünk egy tárgylemezre, és baktériumhurokkal hozzáadjuk a mikroorganizmusok tenyészetét. Ezután, miután a víz teljesen megszáradt, rögzítjük a kenetet - az üveglemezt többször átvisszük az égő lángjára. A Gram-festés hatékonyabb, mint az élő baktériumokkal történő festés – a festékmolekulák jobban kötődnek az elh alt sejtekhez.
A színezés több lépésben történik:
- Apró szűrőpapírdarabokat helyezünk egy rögzített kenetre, és ráöntjük a fő festéket - enciánibolya vagy metilénkéket.
- 3-5 perc elteltével távolítsa el a színes szűrőpapírt, és töltse fel a kenetet Lugol-oldattal 1 percig. Ebben az esetben a készítmény elsötétül.
- A Lugol oldatot lecsepegtetjük, és a kenetet tiszta etil-alkohollal kezeljük: néhány cseppet a készítményre csepegtetünk, majd 20 másodperc múlva lecsepegtetjük. Az eljárást 2-3 alkalommal megismételjük.
- Öblítse le a tesztlemezt desztillált vízzel.
- Készítsen további festést – fejezze be az előkészítést fukszinnal. 1-2 perc elteltével a festéket lemossuk.
- Miután a víz megszáradt, vizsgálja meg a kenetet mikroszkóp alatt. A Gram-pozitív baktériumok kékeslila színűek, a Gram-negatív baktériumok rózsaszínűek vagy pirosak.
Eltérő festési minták okai
A fent leírtak szerint a baktériumok Gram-festése a Gram-pozitív baktériumokat kékeslilára, míg a Gram-negatív baktériumok vörösre vagy rózsaszínre festik. A baktériumok ezzel a módszerrel történő eltérő festődésének az az oka, hogy miután az enciánibolya oldható formája a sejtbe kerül, a festék átmegy az oldhatatlan jód formába. A baktériumok etil-alkohollal történő kezelése során a lipidek kivonódnak a membránból ennek a nem poláris oldószernek a hatására. A membrán ekkor porózussá válik, és már nem jelent jelentős akadályt a festék kimosódásában. azonbanA peptidoglikán jobban ellenáll a nem poláris oldószereknek, beleértve az alkoholt is. Ő akadályozza meg a festék kimosását, így a vastag mureinrétegű baktériumok kékeslilává (gram-pozitívvá) válnak, és alkoholos kezelés után nem változtatják meg a színüket.
A Gram-negatív baktériumok vékony mureinrétege nem tudja megtartani a sejtben lévő festékmolekulákat, ezért alkohol hatására színtelenné válnak - Gram-negatív foltok.
A kenet fukszinnel való érintkezése után a Gram-festéssel festett baktériumok kékeslila színűek maradnak, míg a Gram-negatív baktériumok rózsaszínes-pirossá válnak.
Példák Gram(+) és Gram(-) baktériumokra
A Gram-negatív baktériumok közé tartoznak a cianobaktériumok, kénbaktériumok, vasbaktériumok, chlamydia, rickettsia, ecetsavbaktériumok, sok metilobaktérium, tionos baktérium, arsenitobaktérium, karboxibaktérium.
A bifidobaktériumok, számos vízi baktérium, a streptococcusok és a staphylococcusok Gram-pozitívak.
